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Jul 14, 2023

Astrozyte

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12799 (2023) Diesen Artikel zitieren 264 Zugriffe auf Metrikdetails Wir haben zuvor gezeigt, dass Schutz vor einem drohenden kortikalen ischämischen Schlaganfall besteht

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12799 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Wir haben zuvor gezeigt, dass Schutz vor einem drohenden kortikalen ischämischen Schlaganfall durch sensorische Stimulation des ischämischen Bereichs in einem erwachsenen Rattenmodell mit permanentem Verschluss der mittleren Hirnarterie (pMCAo) erreicht werden kann. Wir haben außerdem gezeigt, dass ein wichtiger Grundmechanismus, der für einen solchen Schutz notwendig ist, das Kollateralsystem zwischen Hirnarterien ist, das zu einer Reperfusion des ischämischen MCA-Gebiets führt. Da ein solcher Kollateralfluss jedoch schwach ist, kann er für den Schutz notwendig, aber nicht ausreichend sein. Deshalb haben wir nach anderen ergänzenden Mechanismen gesucht, die zum sensorischen Schutz beitragen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Aktivierung des Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttles (ANLS) ein weiterer potenzieller Grundmechanismus sein könnte, der den Kollateralfluss im Schutzprozess ergänzt. Mithilfe funktioneller Bildgebung, pharmakologischer Behandlungen und postmortaler Histologie haben wir unsere Hypothese gestützt und gezeigt, dass ANLS eine entscheidende Rolle beim auf sensorischer Stimulation basierenden Schutz des Kortex spielt und daher als weiterer unterstützender Mechanismus dient, der dem Schutzprozess zugrunde liegt.

Unter Verwendung eines permanenten Verschlusses der mittleren Hirnarterie (pMCAo) in einem Rattenmodell für einen ischämischen Schlaganfall (Abb. 1) haben wir den Schutz vor einem drohenden ischämischen Schlaganfall durch sensorische Stimulation nachgewiesen, die innerhalb eines zweistündigen Schutzzeitfensters nach ischämischem Beginn erfolgt1,2,3. 4,5,6,7,8. Welche Mechanismen liegen dieser sensorischen Neuroprotektion in diesem Rattenmodell zugrunde? Wir haben gezeigt, dass eine notwendige Komponente für einen solchen Schutz das piale Kollateralsystem (leptomeningeale Anastomosen) ist, das einen retrograden Blutfluss von anderen kortikalen Arterien zum verschlossenen MCA gewährleistet, was zu einer Reperfusion des ischämischen Bereichs führt1. Mithilfe der optischen Doppler-Kohärenztomographie (DOCT), die eine direkte Quantifizierung des kortikalen Blutflusses und -flusses ermöglicht, stellten wir fest, dass die sensorische Stimulation nach pMCAo tatsächlich den retrograden kollateralen Blutfluss und -fluss in den dauerhaft verschlossenen MCA9 steigerte. Trotz dieser Verbesserung blieben der kollaterale Blutfluss und -fluss jedoch während der ersten kritischen Stunden für den Schutz nach pMCAo9 auf einem sehr niedrigen Niveau. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Kollateralfluss zwar für den Neuroschutz des ischämischen Kortikalisgewebes notwendig, aber möglicherweise nicht ausreichend ist. Wir suchten daher nach einem weiteren komplementären Mechanismus, der ebenfalls an der sensorischen Neuroprotektion beteiligt sein könnte.

Lage der MCA (mittlere Hirnarterie), der Barrel Fields und des Infarkts. (A) zeigt die MCA-Okklusionsstelle (grüner Begrenzungskreis), an der sie gebunden ist, und den Barrel-Cortex (in Gelb, C2-Whisker-Barrel), Bild aus unserer vorherigen Studie1. (B) Die grüne Ellipse zeigt den schwarzen Faden, der für die MCA-Okklusion verwendet wird, und der gelbe Kreis zeigt die ungefähre Position der C2-Whisker-Reaktion. (C) Oben: TTC-Schnitt der Infarktregion in Weiß (durch einen Pfeil angezeigt) bei einer Ratte mit permanentem Verschluss der mittleren Hirnarterie (pMCAo) ohne sensorische Stimulation; Unten: TTC-Schnitt der geschützten Region (keine weiße Region, durch einen Pfeil angezeigt) in einer pMCAo-Ratte mit sofortiger (+ 0 h) Stimulation (2 h lange C2-Whisker-Stimulationen direkt nach pMCAo), Bild aus unserer vorherigen Studie5 .

Das Energiemanagement des Gehirns basiert auf kollaborativen und dynamischen Interaktionen von Neuronen-Glia-Gefässen (NGV), die an der Energieproduktion, -übertragung und -nutzung beteiligt sind10,11,12,13. In den letzten Jahren gibt es zunehmend Belege für die Bedeutung des Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttles (ANLS), der Laktat als Quelle für den Energiebedarf aktivierter Neuronen bei Bedarf und als bevorzugte Energiequelle für einige Neuronen bereitstellt10,11,14,15 ,16,17,18,19,20,21. Es gibt zwei Formen von ANLS, die in gesunden Tiermodellen auftreten und zur Laktatfreisetzung aus Astrozyten führen15. Die eine basiert auf der astrozytischen Glykogenolyse und die andere auf der Glukoseaufnahme der Astrozyten, die ihren Stoffwechsel durch aerobe Glykolyse aktiviert, was beides zur Laktatproduktion führt21,22. Eine aktuelle Studie hat ergeben, dass die Energieversorgung der Neuronen bei gesunden Tieren entscheidend vom Grad der neuronalen Aktivität abhängt15. Bei geringer neuronaler Aktivität nehmen Neuronen Glukose direkt aus dem Blut auf, wohingegen hohe Werte oder intensive neuronale Aktivität zu einer Verlagerung von Glukose- auf Laktatnutzung durch Neuronen führen. Da der sensorische Schutz nach pMCAo von der evozierten Aktivierung von Neuronen im ischämischen Bereich abhängt, stellten wir die Hypothese auf, dass ähnliche neuronale aktivitätsabhängige Mechanismen im ischämischen Kortex beteiligt sind. Dementsprechend könnte ANLS als Reaktion auf sensorisch hervorgerufene neuronale Stimulation aktiviert werden und so die Neuroprotektion des ischämischen Territoriums unterstützen. Um diese Hypothese anzugehen, verwendeten wir im Anschluss an pMCAo pharmakologische Manipulationen, die die Laktattransporter auf kortikalen Neuronen blockierten, die sich während der sensorischen Stimulation im ischämischen Gebiet befanden. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass der Laktat-Shuttle auch ein notwendiger ergänzender Grundmechanismus für die sensorische Neuroprotektion im Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls ist, und unterstreichen die Bedeutung sensorisch aktivierter Astrozyten für die Neuroprotektion. Diese Ergebnisse zeigen zusammen mit unseren früheren Erkenntnissen, die zeigen, wie sensorische Stimulation den post-pMCAo-Aufbau von Infarkten minimiert, was eine weitverbreitete kortikale Synchronisation spontaner lokaler Feldpotentiale (LFPs) vorhersagt23,24, wie Schutz vor drohendem ischämischen Schlaganfall durch sensorische Stimulation ist mehrdimensional und umfasst alle Komponenten von NGV, vom Kollateralsystem über ANLS bis hin zur neuronalen Aktivität.

Alle Verfahren folgten den NIH-Richtlinien und wurden vom UC Irvine Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokollnummer: AUP-21-065). Alle Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet.

Zweiunddreißig Versuchspersonen, männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 230–450 g (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA), wurden einzeln in ausgestatteten Käfigen gehalten und nach einem Zwölf-Stunden-Zyklus in einen Raum mit kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Licht gebracht (6-18 Uhr). Jede Ratte wurde vor dem Experiment drei bis fünf Tage lang täglich zwanzig Minuten lang behandelt.

Es ist bekannt, dass der Laktattransport zwischen Astrozyten und Neuronen über Monocarboxylattransporter (MCT) erfolgt. MCTs sind allgegenwärtig exprimierte Plasmamembranproteine, die für den protonengebundenen Transfer von Molekülen mit einer Carboxylatgruppe durch die Zellmembran verantwortlich sind25. Die Transporter werden sowohl von Astrozyten als auch von Neuronen exprimiert. Im Gehirn exprimieren die Endothel- und Gliazellen MCT1 und MCT4, während Neuronen MCT2 exprimieren. Es wird angenommen, dass die MCTs 1 und 4 hauptsächlich Laktat freisetzen, wohingegen; MCT2 nimmt Laktat26 auf. α-Cyano-4-hydroxycinnamat (4-Cin) ist ein kompetitiver, nicht transportierbarer Inhibitor von MCTs. Frühere Berichte haben gezeigt, dass 4-Cin aufgrund der unterschiedlichen IC50-Werte zwischen den MCT-Isoformen selektiv MCT2 und nicht die MCTs 1 und 4 hemmt27,28,29. Basierend auf einer umfassenden Literaturrecherche zu 4-Cin-Konzentrationen werden in dieser Studie 0,5 ml 8,6 mM 4-Cin, gelöst in 4,5 % Dimethylsulfoxid (Dmso, ein polares Lösungsmittel), verwendet28,2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Wird für die Post-Mortem-Histologie verwendet, um den Infraktbereich hervorzuheben und zu quantifizieren. Alle Medikamente werden von Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA gekauft.

In dieser Studie haben wir ein subjektinternes Design angewendet, bei dem eine Basislinie erstellt und mit dem Ergebnis nach der Manipulation verglichen wird. Zweiunddreißig Probanden wurden von einem Experimentator, der keine Ahnung von den Versuchsprotokollen hatte, zufällig einer von vier Versuchsgruppen zugeordnet. Die Whisker-Stimulation unmittelbar nach der Okklusion wird als + 0 h bezeichnet. Alle Versuchsgruppen sind in Abb. 2D im Detail dargestellt. Ratten in Gruppe 1 (n = 8) erhielten die Anwendung von Vehikel (Dmso, 4,5 %) und + 0 h Whisker-Stimulation, aber kein pMCAo. Ratten in Gruppe 2 (n = 8) erhielten eine Scheinbehandlung wegen MCA-Okklusion, MCT-Inhibitor (4-CIN, 8,6 mM) und + 0 h Stimulation. Ratten in Gruppe 3 (n = 8) erhielten pMCAo, Vehikel (Dmso) und + 0 h Stimulation. Ratten in Gruppe 4 (n = 8) erhielten pMCAo, MCT-Inhibitor (4-Cin) und unmittelbar nach dem Verschluss eine Whisker-Stimulation (+ 0 Stunden). Die Gruppen 1–3 dienen als drei verschiedene Kontrollgruppen für Gruppe 4. Der detaillierte Zeitplan des vollständigen Versuchsprotokolls ist in Abb. 2A dargestellt.

Experimentelles Design und chirurgische Verfahren. (A) Der detaillierte Zeitplan des Experiments. (B) Schwarze und weiße Pfeilspitze (oben) zeigen Bregma bzw. Lambda. Die dicke blaue Linie zeigt den für ISOI ausgedünnten Schädelbereich. Der kleine grüne Bereich wird für pMCAo ausgedünnt. (C) Verdünnter Bereich (ungefährer Dickenbereich 24–32 µm), vorbereitet für die optische Bildgebung mit intrinsischem Signal, ISOI; Der darunter liegende Kortex und die Gefäße sind deutlich sichtbar. (D) Die medikamentöse Intervention, die MCA-Behandlung, Einzelheiten der Whisker-Stimulation und die zugewiesene Farbe für jede Versuchsgruppe sind tabellarisch aufgeführt. (E) MCA nach Kraniotomie und Durotomie. Die schwarze Pfeilspitze zeigt auf die dorsale MCA. (F) Zwei Fäden werden unter MCA geführt und locker geknotet. (G) Permanent doppelt geknoteter MCA. (H) Eine Vaseline (Vaseline), gut gefüllt mit Kochsalzlösung/Medikament. (I,J) tabellarisch die Parameter von Stimulationsprotokollen mit spärlicher bzw. kondensierter Whisker-Stimulation aufgeführt.

Zu Beginn jedes Experiments wurden die Probanden kurzzeitig mit 4 % Isofluran betäubt und ihnen wurde intraperitoneal (ip) ein Natriumpentobarbital-Bolus (55 mg/kg Körpergewicht (KG)) injiziert. Bei Bedarf wurden zusätzliche Injektionen (14 mg/kg Körpergewicht) verabreicht, um den Verlust des Rückzugsreflexes beim Zehen-/Schwanzklemmen aufrechtzuerhalten. Der C2-Whisker wurde identifiziert und die verbleibenden Whisker wurden vor Beginn der chirurgischen Eingriffe abgeschnitten. Zu Beginn und am Ende des ersten Versuchstages wurden 5 % Dextrose (3 ml) und Atropin (0,05 mg/kg, Körpergewicht) verabreicht. Die Körpertemperatur wurde kontinuierlich über eine Rektalsonde gemessen und durch eine selbstregulierende Wärmedecke auf 37° Celsius gehalten. Während des gesamten Experiments wurden auch die Herzfrequenz und die teilweise Sauerstoffsättigung überwacht.

Es wurde ein Einschnitt in der Mittellinie durchgeführt und das Weichgewebe wurde reseziert, um einen etwa 7 mm × 7 mm großen „Bildgebungsbereich“ des Schädels über dem linken primären somatosensorischen Kortex (rostromediale Ecke kaudal und lateral vom Bregma positioniert) freizulegen, der auf etwa 24–24 mm ausgedünnt wurde. 32 μm mit einem Dentalbohrer, wie in Abb. 2B,C gezeigt. Nach der grundlegenden optischen Bildgebung mit intrinsischem Signal (ISOI) der Whisker-Funktionsdarstellung (WFR) des Whiskers C2 wurde der Schädel angehoben und 1–4 Schlitze in der Dura im oder um den Bereich C2 WFR gemacht (siehe unten).

Am Ende der Bildgebungssitzungen am ersten Tag wurde ein Analgetikum (Flunixin-Meglumin) subkutan injiziert (2 mg/kg). Die geschlossene Wunde wurde mit topischen Antibiotika (Antimax, Petco) abgedeckt und die Ratten wurden überwacht, während sie sich von der Narkose erholten. Die Ratten wurden in ihren Heimkäfig zurückgebracht und konnten sich über Nacht vor dem 24-Stunden-ISOI (bezeichnet als 24-Stunden-ISOI) erholen. Nach der 24-stündigen ISOI wurden die Ratten mit einer tödlichen Dosis Euthasol (2 ml, ip) eingeschläfert und für die Histologie vorbereitet. Der Zeitplan und die Vorgehensweise des Experiments sind in Abb. 2 dargestellt.

Das Verfahren zur Dura-Schlitzung wurde gegenüber unserem zuvor berichteten Verfahren angepasst und verbessert30. Bei diesem Verfahren wurde die vollständige Kraniotomie des Bildfensters durch kleine, ausgerichtete Schädelschlitze mit Dura-Schlitzen ersetzt. Alle Schritte wurden bei 50–120-facher Vergrößerung durchgeführt und sind in Abb. 3 dargestellt. Mit einer feinen Pinzette wurde eine kleine Öffnung in den verdünnten Schädel gemacht und der Schädellappen vorsichtig angehoben und gebogen, wie in Abb. 3A, B gezeigt. Bemerkenswert ist, dass der Schädel nur angehoben, aber nicht entfernt oder abgetrennt wird. Die Spitze der 30G-Nadel wurde gebogen, um die Dura zu greifen und nach oben zu heben, weg von der Kortikalis, wie in Abb. 3C gezeigt. Der Schlitz der gewünschten Größe wurde mit dem scharfen Teil der Nadel in die Dura gebohrt, während diese angehoben war und keinen Kontakt mit der Kortikalis hatte (Abb. 3D). Nachdem der Schlitz auf die richtige Größe zugeschnitten war, wurde die Nadel vorsichtig von der Dura getrennt. Mit einer Mikroschere wurde ein kleiner Schlitz in den Schädel gemacht, der auf den/die Dura-Schlitz(e) ausgerichtet war. Der dünne Schädel wurde dann in seine ursprüngliche Position zurückgebracht, wie in Abb. 3G gezeigt. Vergrößerte Bilder des Dura-Schlitzes und des ausgerichteten Dura-Schädel-Schlitzes sind in Abb. 3F bzw. G dargestellt. Durch die Herstellung ausgerichteter Schlitze sowohl im ausgedünnten Schädel als auch in der Dura gewährleistet dieses Verfahren eine minimale Gewebeschädigung, beugt kortikalen Herniationen vor und reduziert kortikale Bewegungsartefakte während der Bildgebung.

Ausgerichtete Schädel- und Dura-Schlitze. (A) In den ausgedünnten Schädel wird eine kleine Öffnung eingebracht, um einen Teil davon anzuheben. Der weiße Streifen ist die Reflexion des Deckenlichts. (B) Blaue Pfeile zeigen den angehobenen Schädel. (C) Mit einem gebogenen 30G-Nadelhaken wird eine kleine Öffnung in der Dura hergestellt. (D,E) Dura-Schlitz der gewünschten Größe wird hergestellt. Blaue Pfeile zeigen die zurückgezogene Dura nach dem Schlitz bei 120-facher Vergrößerung. (F) Der Schädelschlitz auf halbem Weg zu seiner ursprünglichen Position, blauer Pfeil. (G) Ausgerichtete Dura-Schädel-Schlitze bei 150-facher Vergrößerung, begrenzt durch ein blau gepunktetes Dreieck.

Dieses Verfahren wurde erstmals von Davis et al.31 demonstriert und beschrieben. Kurz gesagt, die Basis der linken mittleren Hirnarterie ist am M1-Segment dauerhaft verschlossen und blockiert den Fluss zu allen MCA-Kortikalisästen. Dazu werden Schädel und Dura vorsichtig aus einem 1,5 × 1,5 mm großen „chirurgischen Fenster“ direkt vor und seitlich des Bildgebungsfensters entfernt (über dem M1-Segment von MCA, direkt distal zu den linsenförmigen Ästen von MCA und proximal zu etwaigen kortikalen Verzweigungen). wie in Abb. 2B,E gezeigt. Eine kleine Nadel wird mit einem Seidenfaden der Stärke 8–0 durchzogen und an zwei Stellen durch die Pialschicht der Hirnhäute geführt, unterhalb der MCA, wie in Abb. 2F gezeigt. Beide Fäden werden dann fest um MCA gebunden (Abb. 2G). Es wird darauf geachtet, eine Beschädigung der Arterie zu vermeiden, und die Experimente werden abgebrochen, wenn es zu einer Blutung der MCA kommt. Für die Scheinoperationsgruppe wird das gleiche Verfahren angewendet, jedoch ohne die endgültige Bindung. Die Lage des verknoteten MCA in Bezug auf die Fassfelder und die ungefähre Lage des C2-Fasses ist in Abb. 1A,B dargestellt.

Um das Bildfenster herum wurde eine Vertiefung mit Vaseline (Vaseline) angebracht und mit Kochsalzlösung für den Basislinien-ISOI gefüllt, wie in Abb. 2H dargestellt. Anschließend wurde die Vertiefung mit dem Medikament/Vehikel gefüllt und mit einem Deckglas abgedeckt. Das Medikament konnte eine Stunde vor pMCAo und zwei Stunden nach pMCAo durch Schädel-/Dura-Schlitze in das kortikale Gewebe diffundieren, da zwei Stunden nach pMCAo das kritische Zeitfenster für den sensorischen Neuroschutz sind6.

Eine detaillierte Beschreibung der ISOI-Datenerfassung und -analyse finden Sie an anderer Stelle32,33,34. Kurz gesagt, eine CCD-Kamera (Charge Coupled Device) (16-Bit Cascade 512F, Photometrics, Tucson, AZ, USA), ausgestattet mit einem invertierten 50-mm-AF-Nikon-Objektiv (1:1:8, Melville, NY, USA) kombiniert mit einem Der Extender (Modell PK-13, Nikon, Melville, NY, USA) wird für die Bildgebung verwendet und von der V++ Precision Digital Imaging System-Software (Digital Optics, Auckland, NZ) gesteuert. Die Daten werden in 100-ms-Frames erfasst, die zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zu 500-ms-Frames summiert werden. Der Kortex wird mit einer einzelnen roten Leuchtdiode (Wellenlänge 635 ± 15 nm) beleuchtet. Sofern nicht anders angegeben (z. B. Abb. 4), wurde ISOI bei der Basislinie vor pMCAo und 24 Stunden nach pMCAo angewendet, daher ist der zweite Bildgebungszeitpunkt in Abb. 1 nur durch eine gestrichelte Linie dargestellt.

ISOI-WFR von Whisker C2 während des Protokolls mit geringer Stimulation. Die blaue Linie zeigt den Beginn des 500-ms-Prestimulus-Bildes. Rote Linien zeigen den Beginn und das Ende einer 5 Hz-1 s langen Whisker-Stimulation. Die obere Reihe zeigt eine typische 3-Phasen-ISOI-WFR-Reaktion auf die Stimulation zu Beginn, während die untere Reihe das Fehlen des ISOI-WFR als Reaktion auf die identische Stimulation in Gegenwart eines MCT-Inhibitors zeigt. Bei den beiden Bildserien handelt es sich um zusammengefasste Antworten von 64 Versuchen. Der lineare Graustufenbalken zeigt die intrinsische Signalstärke an (± 0,00025), C und L bezeichnen kaudal bzw. lateral. Jeder Rahmen ist ca. 7 mm × 7 mm groß. Schwarze und weiße Streifen sind großflächige Artefakte von Blutgefäßen.

Zwei Arten von Whisker-Stimulationsprotokollen, spärlich und kondensiert, werden während der Bildgebung zu Studienbeginn und nach 24 Stunden angewendet. Das Sparse-Protokoll wird verwendet, da es die gleiche zeitliche Abfolge funktioneller Reaktionsphasen erzeugt, wie sie auch durch leistungsstarkes (Hoch-Tesla) BOLD-fMRT abgebildet wird, ein Protokoll, das in allen unseren vorherigen Arbeiten konsequent angewendet wurde1,2,3,4,5,6 ,7,8. Es wird ein komprimiertes Protokoll verwendet, da es das naturalistische Muster des Rührens bei wachen Tieren nachahmt35.

Sparse-Protokoll: Während jedes 15-s-Versuchs des Sparse-Protokolls wurden 1,5 s Daten vor dem Stimulus, 1 s während des Stimulus und 13,5 s Daten nach dem Stimulus gesammelt, mit einem zufälligen Intervall zwischen den Versuchen von 6 ± 5 s.

Verdichtetes Protokoll: Während jedes 4,5-s-Versuchs des verdichteten Protokolls wurden 1,5 s Daten vor dem Stimulus, 1 s während des Stimulus und 2 s Daten nach dem Stimulus gesammelt, mit einem konstanten Intervall von 1 s zwischen den Versuchen.

Bei beiden Protokollen bestand der Stimulus darin, dass ein einzelner Whisker in jedem Versuch um 9° in rostral-kaudaler Richtung mit einer Rate von 5 Hz für eine Gesamtstimulusdauer von 1 s abgelenkt wurde. Die Daten werden in Blöcken von 64 Stimulationsversuchen für das spärliche Protokoll und in Blöcken von 40 für das Protokoll mit kondensiertem Schneebesen gesammelt. Alle Post-pMCAo-Stimulationen (+ 0 h) bestanden aus vier Blöcken von 64 spärlichen Whisking-Stimulationen, die zuvor in diesem Modell als neuroprotektiv beschrieben wurden (als Referenz Abb. 1C)1,2,3,4,5,6,7,8 . Der Ort des Infarkts nach pMCAo bei Ratten, die keine Whisker-Stimulation erhalten, ist in Abb. 1C dargestellt. Bei allen Tieren werden 256 Versuche mit Whisker-Stimulation unmittelbar nach pMCAo als + 0-Stunden-Stimulation bezeichnet1,2. Die Parameter sowohl der spärlichen als auch der komprimierten Protokolle sind in Abb. 2I-J dargestellt.

Aus Rohbildern wurden Verhältnisbilder erstellt, indem die fraktionierten Änderungswerte (FC) berechnet wurden, indem jeder 500-ms-Rahmen der Signalaktivität nach dem Stimulus durch den 500-ms-Rahmen der intrinsischen Signalaktivität vor dem Stimulus dividiert wurde, der unmittelbar vor Beginn des Stimulus erfasst wurde. WFR für das Sparse-Protokoll zeigt drei verschiedene Phasen nach der Stimulation. Die drei Phasen sind, in der Reihenfolge ihres Auftretens, der anfängliche Abfall (typischerweise dunkel im Verhältnis zur Grundlinie vor dem Reiz), das Überschwingen (typischerweise hell im Verhältnis zur Grundlinie) und das Unterschreiten (topisch dunkel im Verhältnis zur Grundlinie)34. 36 siehe zum Beispiel die obere Reihe Abb. 4. Wenn der Kortex mit Rot (635 nm) beleuchtet wird, stellt der anfängliche Abfall den Anstieg des Desoxyhämoglobins aufgrund der sofortigen Sauerstoffunterstützung für die neuronale Aktivierung dar, der Überschuss stellt die vaskuläre Reaktion des Blutflusses dar Der aktivierte Bereich ist auf einen Anstieg des Oxyhämoglobins zurückzuführen (ähnlich der BOLD-Reaktion von fMRT), und die zugrunde liegende Quelle des Unterschwingens ist noch unklar36,37. Wie in unseren vorherigen Veröffentlichungen haben wir nur die ersten beiden Phasen analysiert und daher zeigt Abb. 5 nur 7 s der Datenerfassung und nicht 13,5, wie in Abb. 4 gezeigt. Das komprimierte Protokoll zeigt jedoch nur eine einzige Wachstumsphase tauchen.

Ein repräsentatives Ergebnis für jede Versuchsgruppe nach dem Protokoll zur spärlichen Whisker-Stimulation (obere Hälfte) und der kondensierten Whisker-Stimulation (untere Hälfte). Die ISOI-Ergebnisse zu Studienbeginn und nach 24 Stunden werden für jede Versuchsgruppe angezeigt (Beschreibung in der Spalte „Versuchsbedingungen“). Die 1-s-Zeitmarkierung bezeichnet den Beginn und das Ende einer 1-s-5-Hz-Whisker-Stimulationsimpulsfolge. Die gelben und grünen Kreise zeigen die spezifischen Rahmen, die die interessierenden Bereiche umfassen, die zur Quantifizierung des anfänglichen Einbruchs bzw. Überschwingens verwendet werden. Der lineare Graustufenbalken zeigt die intrinsische Signalstärke ± 0,00025 an, C und L bezeichnen kaudal bzw. lateral. Jeder Rahmen ist ca. 7 mm × 7 mm groß. Schwarze und weiße Streifen sind großflächige Artefakte von Blutgefäßen. Die dicke rote Linie ist die Skala für 1 mm.

Die Verhältnisbilder, die die maximale Flächenausdehnung für jede intrinsische Signalphase enthalten, wurden ausgewählt und Gauß-gefiltert (halbe Breite = 5). Die Flächenausdehnung wurde bei einem Schwellenwert von 1,75 × 10–4 für den anfänglichen Abfall und bei einem Schwellenwert von 2,5 × 10–4 (fraktionelle Änderung ΔR/R-Einheiten) für das Überschwingen, weg von Null, quantifiziert. Die Spitzenamplitude wurde in Bruchteilen der Änderungseinheiten für das Pixel mit Spitzenaktivität innerhalb der Flächenausdehnung quantifiziert. Bemerkenswert ist, dass zum Vergleich der Veränderungen zwischen der Grundlinie und 24 Stunden in allen Versuchsgruppen das Pixel mit der höchsten Intensität im Bereich des Schädel-Dura-Schlitzes (Arzneimitteldiffusionsbereich) ausgewählt wurde.

Da räumliche Parameter für den anfänglichen Abfall und das Überschwingen auf einem einzelnen 500-ms-Frame basieren, wurden zeitliche Profile von allen 500-ms-Frames eines einzelnen ausgewählten Spitzenwertpixels im Bereich der Aligned-Skull-Dura-Schlitze erfasst. Die Zeitparameter wurden zuvor für die WFR angegeben und das zeitliche Perfusionsprofil wird nun für die ISOI-WFR-Analyse verwendet34,38. Die detaillierte Analyse und die Ergebnisse aller Timing-Parameter werden in ergänzenden Materialien berichtet (Abbildung S1 und Abbildung S2).

Das Gehirn wurde in 2 mm koronale Scheiben geschnitten und in 2 % TTC-Lösung bei 37 °C für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert39. TTC wird durch Dehydrogenasen in aktiven Mitochondrien enzymatisch reduziert, wodurch Formazan (ein leuchtend rotes Nebenprodukt) entsteht. Die Intensität der roten Färbung korreliert mit der Anzahl und funktionellen Aktivität der Mitochondrien, ungefärbte (weiße) Bereiche weisen auf einen Infarkt hin40.

Die TTC-gefärbten Schnitte wurden mit einer Digitalkamera fotografiert und die Bilder mit der ImageJ-Software (National Institute of Health) analysiert. Das gesamte Infarktvolumen wurde durch Multiplikation der Infarktfläche jedes Schnitts mit der Dicke dieses Schnitts bestimmt und die Endvolumina wurden dann um Ödeme korrigiert. Ein für die Versuchsgruppen blinder Beobachter führte die Volumenberechnung durch. Kleine Schäden an der pMCAo-Operationsstelle konnten leicht vom großen ischämischen Infarkt unterschieden und von der Infarktanalyse ausgeschlossen werden. Die Bilder mit Infarkt in Gruppe 4 wurden mit den Bildern aus dem Gehirnatlas der Ratte (Pixanos und Watson) überlagert41. Die Atlasbilder wurden anhand der in den Schnitten beobachteten Orientierungspunkte ausgewählt.

Für ISOI-WFR-Bildgebungsdaten wurde eine Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (RM-ANOVA) durchgeführt, um mögliche Unterschiede zwischen dem Ausgangswert und 24 Stunden nach pMCAo in allen Versuchsgruppen zu analysieren. Wiederholte Messungen wurden für eine zwischen der Variablen des Probanden (Versuchsgruppen 1–4) und eine innerhalb der Probanden (Zeit, Ausgangswert vs. 24 Stunden) durchgeführt, gefolgt von Post-hoc-Kontrasten, um festzustellen, welche Gruppen sich nach 24 Stunden vom Ausgangswert unterschieden. Der Alpha-Wert wurde auf 0,05 eingestellt und es wurden Bonferroni-Korrekturen angewendet, um mehreren Kontrasten Rechnung zu tragen. Vergleiche des Infarktvolumens wurden mithilfe von T-Tests mit zwei Stichproben durchgeführt. Eine einfaktorielle ANOVA wurde mit Post-hoc-Bonferroni-Korrekturen durchgeführt, um sicherzustellen, dass kein statistischer Unterschied zwischen den Ausgangswerten aller Gruppen (1–4) besteht. Alle Statistiken und Darstellungen wurden mit PRISM (GraphPad Version 9) durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und Standardfehler ausgedrückt.

Die Blockierung von ANLS durch MCTs beeinflusst die WFR während der Behandlungszeit, ein Effekt, der während der Anwendung von MCT-Inhibitoren in den Gruppen 2 und 4 abgebildet wird. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Beispiel der ISOI-WFR in Abwesenheit (obere Reihe) und Anwesenheit (untere Reihe). MCT-Hemmer, bei dem die ausgeprägten drei Phasen der WFR verschwinden. Dieser Effekt war nur während der MCT-Hemmung durch 4-Cin-Anwendung vorhanden (Gruppen 2,4).

Der Unterschied zwischen den Versuchsgruppen 2 und 4 ist jedoch 24 Stunden nach der 4-Cin-Behandlung erkennbar. Nur Gruppe 4 zeigt kein WFR, während Gruppe 2 eine vollständige Erholung des WFR zeigt (Abb. 5 und 6). Diese Ergebnisse stimmten sowohl für die Protokolle mit kondensiertem als auch mit spärlichem Schneebesen überein.

Die räumliche Quantifizierung der ISOI-WFR-Phasen für die beiden Stimulationsparadigmen (spärlich und kondensiert). Obere Reihe: Spitzenamplitude und Fläche des anfänglichen Abfalls nach Anwendung der spärlichen Whisker-Stimulation zu Beginn im Vergleich zu 24 Stunden (24 Stunden) für jede der Versuchsgruppen. Die Diagramme zeigen einen signifikanten Unterschied nur für Gruppe 4 zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden sowohl für Peak als auch für Fläche (****p < 0,0001 und *p < 0,05). Mittlere Reihe: Spitzenamplitude und Bereich des Überschwingens zu Beginn im Vergleich zu 24 Stunden nach dem spärlichen Protokoll werden für jede der Versuchsgruppen angezeigt. Ein signifikanter Unterschied ist nur für Gruppe 4 erkennbar (***p < 0,0021). Untere Reihe: Spitzenamplitude und Fläche des anfänglichen Einbruchs nach dem Protokoll zur Stimulation des kondensierten Whiskers zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden für jede der Versuchsgruppen. Die Grafik zeigt einen signifikanten Unterschied nur für Gruppe 4 zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden sowohl für den Peak als auch für die Fläche (***p < 0,0021 und **p < 0,03). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Ausgangswerten aller Gruppen für alle quantifizierten Parameter (p > 0,1).

Abbildung 5 (obere Hälfte) zeigt für jede Versuchsgruppe einen repräsentativen Fall einer Whisker-Funktionsdarstellung (WFR) zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden nach dem spärlichen Stimulationsprotokoll. Für die Versuchsgruppe 4 wurde 24 Stunden nach pMCAo kein WFR wiederhergestellt. Umgekehrt bleibt die WFR bei allen Kontrollgruppen (1–3) 24 Stunden nach den Eingriffen intakt. Abbildung 5 (untere Hälfte) zeigt für jede Versuchsgruppe einen repräsentativen Fall einer Whisker-Funktionsdarstellung (WFR) zu Studienbeginn im Vergleich zu 24 Stunden nach dem Protokoll der komprimierten Stimulation. Auch hier wurde für die Versuchsgruppe 4 24 Stunden nach pMCAo kein WFR wiederhergestellt. Umgekehrt bleibt die WFR bei allen Kontrollgruppen (1–3) 24 Stunden nach den Eingriffen intakt.

Die experimentellen Ergebnisse zu Beginn und nach 24 Stunden für die Flächenausdehnung und Spitzenamplitude, wie sie für die anfänglichen Einbruchs- und Überschwingungsphasen während der Anwendung des Sparse-Protokolls quantifiziert wurden, sind in Abb. 6 im oberen und mittleren Teil dargestellt. Nur Gruppe 4 zeigt eine signifikante Abnahme sowohl des Spitzenwerts als auch der Flächenausdehnung (als „Fläche“ bezeichnet) des anfänglichen Einbruchs und Überschwingens. Wir haben die vollständige Eliminierung nach 24 Stunden außerdem durch das Fehlen von abgebildetem WFR selbst bei der niedrigsten Quantifizierungsschwelle bestätigt. Die Ausgangswerte aller anderen Gruppen zeigen keinen signifikanten Unterschied. Die Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Effekt für die Vehikelanwendung (Dmso) nach pMCAo in Gruppe 3 oder unter normalen Bedingungen in Gruppe 1. Die Hemmung des Laktattransports in der Schein-pMCAo-Gruppe 2 zeigte auch keine signifikante Änderung der Flächengröße und des Spitzenwerts. Abbildung 6 (unten) zeigt die gleichen räumlichen Parameter des anfänglichen Einbruchs während der Anwendung des Protokolls zum kondensierten Rühren. Es zeigt einen ähnlichen Trend wie im oberen und mittleren Teil von Abb. 6, wo der Verlust räumlicher Parameter nur in Gruppe 4 sichtbar ist und alle anderen Gruppen 24 Stunden nach der Behandlung keinen signifikanten Effekt zeigen.

Experimentelle Ergebnisse für zeitliche Parameter der Timing-Analyse sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Wie bei der räumlichen Analyse gab es nur in Gruppe 4 eine signifikante Abnahme der zeitlichen Parameter wie Halbwertszeitverhältnis und Spitzenzeitverhältnis sowohl der anfänglichen Einbruchs- als auch der Überschwingungsphase nach 24 Stunden. Alle anderen Gruppen zeigten keinen signifikanten Unterschied, was darauf hindeutet, dass das Vehikel (Dmso) nach pMCAo (Gruppe 3) und unter normalen Bedingungen (Gruppe 1) keinen signifikanten Effekt hatte. Auch die Blockierung des Laktattransports bei Scheinratten zeigte nach 24 Stunden keine signifikante Veränderung (Abbildung S2) und nur eine vorübergehende Hemmwirkung des WFR während der 4-Cin-Verabreichung (Abb. 4). Alle anderen für die Versuchsgruppen gemessenen Zeitparameter (Zeitdauer, Anstiegs- und Abfallrate, Verhältnis von Minimum zu Maximum und Fläche unter der Kurve) zeigen ebenfalls nur in der Gruppe, in der der Laktat-Shuttle nach pMCAo blockiert ist (Gruppe 4), signifikante Veränderungen. Die nicht signifikante Änderung aller Parameter für alle anderen Gruppen (1–3) lieferte einen weiteren Beweis für die Beständigkeit der funktionellen Reaktion in Gegenwart eines Vehikels und bei Scheintieren.

Das Infarktvolumen wurde für alle Versuchsgruppen (1–4) in Abb. 7A berechnet. Eine weitere Gruppe mit pMCAo und keiner + 0-Stunden-Stimulation aus unserer vorherigen Studie wird als Referenz hinzugefügt5. Gehirnschnitte von einem repräsentativ ausgewählten Tier für jede der Gruppen 1–4 sind in Abb. 7B,C dargestellt. Die Überlagerung des Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson anhand der Orientierungspunkte der Schnitte in Abb. 7C zeigt den resultierenden Infarkt nach pMCAo in einem Fall, in dem der Laktattransport über einen großen kortikalen Bereich blockiert ist (größter Fall von Schädel-Dura-Schlitzen). Die Überlagerung der TTC-Schnitte mit dem Gehirnatlas der Ratte zeigt einen Infarkt, der Teile des primären motorischen Kortex, des primären somatosensorischen Kortex, des auditorischen Kortex bis hin zu Teilen des primären visuellen Kortex umfasst und sich fast über das gesamte MCA-Territorium erstreckt42.

TTC-Quantifizierung des Infarkts bzw. des Fehlens eines Infarkts in allen Versuchsgruppen. (A) Infarktvolumen aus allen Versuchsgruppen (1–4). Die Infarktvolumina für die Gruppe (pMCAo + No-Stim) werden als Referenz hinzugefügt und stammen aus unserer vorherigen Studie5. Gruppenquantifizierung (n = 8 in jeder Gruppe) des Infarktvolumens (****p < 0,0001). (B) Repräsentative Beispiele der TTC-Färbung für Infarkte zeigten keine Schäden und eine vollständige Strukturerhaltung in allen anderen Gruppen (1–3). (C) Hirnschnitte zeigen einen TTC-gefärbten repräsentativen Fall für Gruppe 4 in 2-mm-Schnitten mit Überlagerung des TTC-Ergebnisses auf Bildern aus dem Rattenhirnatlas (Paxinos und Watson41).

Der Ort des Infarkts wurde immer direkt unter dem Schlitz gefunden, wie in Abb. 8A–F dargestellt. Ein Schädel-Dura-Schlitz eliminierte die WFR direkt darunter (Abb. 8A–C), und an zwei verschiedenen Stellen um eine andere WFR herum zeigten sich Infarkte an zwei Stellen um die WFR herum, wodurch Funktion und Struktur der Kortikalis, die nicht vom Dura-Schlitz bedeckt war, erhalten blieben (Abb. 8D). ,F). Daher korreliert die funktionelle und strukturelle Erhaltung direkt mit der Größe des Schlitzes, der für die Arzneimitteldiffusion geschaffen wird, um die MCTs für den Laktattransport zu blockieren, wie unsere Ergebnisse zeigen. Für alle Ratten in Gruppe 4 (pMCAo + 4-Cin + 0 h) zeigen unsere Ergebnisse eine starke lineare Korrelation zwischen der Schlitzgröße und dem Infarktvolumen, wie in der Regressionsanalyse gezeigt (Abb. 8G).

Räumliche Beziehung der Dura-Schlitze zum ISOI-WFR und zum Infarktvolumen. Die Daten von 2 Ratten sind in (A–F) dargestellt. (A,D) Die Bilder zeigen WFR-Bilder, die mit dem Sparse-Protokoll aufgenommen wurden. Für zwei Tiere ist nur der anfängliche Abfall dargestellt. (B,E) zeigen die ungefähre Lage der Schlitze in der Dura und im ausgedünnten Schädel als blaue Kreuze. (C,F) WFR 24 Stunden nach pMCAo- und 4-Cin-Behandlung. Korrelation zwischen Schlitzgröße und Infarktgröße: In C fehlt die WFR und in F bleibt nur das Zentrum übrig. (G) zeigt die lineare Regression der gesamten Schlitzgröße und des Infarkts. Das Infarktvolumen zeigt eine starke lineare Korrelation mit der gesamten Schlitzgröße (R2 = 0,87, p < 0,0001). Schwarze und weiße Streifen sind großflächige Artefakte von Blutgefäßen.

Bei gesunden Nagetieren ist astrozytäres Glykogen, eine Vorstufe von Laktat, die einzige endogene Brennstoffreserve für das Energiemanagement unter stoffwechselintensiven oder gestressten Bedingungen43,44,45. Die Glykogenreserve der Astrozyten wird dynamisch durch Glykogenese und Glykogenolyse aufrechterhalten 46,47. Astrozytisches Glykogen wird während des Stoffwechselbedarfs aktiver Neuronen weiter metabolisiert, um Laktat zu erzeugen und diese aktiven Neuronen somit mit einer zusätzlichen Energiequelle zu ergänzen, um ihre Funktionalität aufrechtzuerhalten15,27,28. Dieser Prozess beginnt, wenn die hervorgerufene synaptische Aktivität eine Glutamatfreisetzung an kortikalen Synapsen verursacht, die wiederum die Glukoseaufnahme in Astrozyten und deren Stoffwechsel durch aerobe Glykolyse auslöst, was zur Laktatproduktion führt und einen Stoffwechselweg des Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttles (ANLS) darstellt48,49. Bei Ausbrüchen erhöhter neuronaler Aktivität erhöht sich auch der glykogenolytische Fluss und der astrozytische glykogenolytische Weg sorgt für eine schnelle Laktatfreisetzung, um den intensiven Energiebedarf zu decken29,50. Das durch Glykolyse und Glykogenolyse in Astrozyten erzeugte Laktat wird über Monocarboxylattransporter (MCTs) in den extrazellulären Raum abgegeben, um von einer oxidativen Stelle, hauptsächlich Neuronen, verbraucht zu werden und den Weg des Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttles (ANLS) zu bilden51. Die Rolle von Laktat, das von Astrozyten als Reaktion auf sensorische Stimulation innerhalb des kritischen 2-Stunden-Zeitfensters des Schutzes produziert wird, war zuvor noch nicht getestet worden. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass das ANLS als Reaktion auf die sensorische Stimulation von Neuronen im ischämischen Bereich der komplementäre Mechanismus zum Kollateralblutfluss im Prozess des Schutzes durch Whisker-Stimulation im Rattenmodell von pMCAo sein könnte. Um unsere Hypothese zu testen, verwendeten wir die Quantifizierung des ISOI nach zwei Stimulationsprotokollen in pharmakologisch behandelten Rattengruppen, um in Echtzeit die Rolle von Astrozytenlaktat in vivo zu untersuchen.

Die Lösung zweier Schlüsselprobleme war ausschlaggebend für den Erfolg der pharmakologischen Anwendungen in dieser Studie: 1) die neuartige Entwicklung der ausgerichteten Schädel-Dura-Schlitze und 2) die Wahl der geeigneten Konzentrationen des Vehikels Dmso und des MCT-Blockers 4-Cin.

1) Für die Medikamentenverabreichung (Abb. 2 und 3) haben wir ausgerichtete Schädel-Dura-Schlitze am oder um den Wirkungsort herum angelegt und dabei ein großes piales Gefäßnetz vermieden. Dieses Präparat hat mehrere Vorteile: a) Kontrollierte Arzneimitteldiffusion über die Zeit nur im Bereich der Schlitze, b) Überlegenheit gegenüber einer intrazerebralen Injektion durch Vermeidung von Schäden an der Kortikalis, c) Keine mechanischen Störungen und keine Arzneimitteltaschen im kortikalen Milieu aufgrund der Druckinjektion, d) Dieses Verfahren schränkt das Medikamentenvolumen nicht ein, wie dies bei Injektionen der Fall ist. e) Durch die Beibehaltung der verdünnten Schädelpräparation mit kleinen Schlitzen von nur 1 mm werden kortikale Herniationen und durch Herzschlag und Atmung verursachte Bewegungsartefakte vermieden, und schließlich f ) Die Größe der Schlitze korreliert linear mit dem kortikalen Volumen, das durch den pharmakologischen Eingriff beeinflusst wird (Abb. 8G).

2) Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Dmso oberhalb einer bestimmten Dosierung potenziell toxisch ist. Daher war es für diese Studie wichtig, eine Konzentration zu verwenden, die für das kortikale Milieu nicht toxisch war52,53, wie vom ISOI bestätigt. Tatsächlich zeigten unsere Ergebnisse in den Kontrollgruppen 1 (Dmso ohne pMCAo) und 3 (Dmso + pMCAo), dass für den WFR keine räumlichen oder zeitlichen Veränderungen festgestellt wurden, was bestätigt, dass die für unsere Studie verwendete Dmso-Konzentration keine toxischen Wirkungen hatte. Die in dieser Studie verwendete Konzentration von 4-Cin lag im mittleren Bereich dessen, was zuvor zur MCT-Hemmung verwendet wurde54,55,56. Diese Konzentration wurde unter Berücksichtigung der Tatsache gewählt, dass die dynamische Diffusion durch den kortikalen extrazellulären Raum die Wirksamkeit des Arzneimittels nicht minimiert und umgekehrt eine Konzentration nicht überschritten wird, die unter normalen Bedingungen räumliche oder zeitliche Auswirkungen auf die WFR haben könnte, wie gezeigt in Kontrollgruppe 2 (Schein-pMCAo + 4-Cin + 0 h).

Wir verwendeten ISOI in Kombination mit pharmakologischer Manipulation von Laktattransportern, um die Rolle von ANLS beim sensorischen Schutz nach pMCAo durch Quantifizierung der WFR über die Zeit aufzudecken. Zuvor haben wir gezeigt, dass Ratten trotz pMCAo einen kortikalen Struktur-, Funktions- und Verhaltensschutz nach Whisker-Stimulation innerhalb eines 2-Stunden-Fensters nach pMCAo1,2,4 zeigen. Durch die pharmakologische Hemmung von MCTs mithilfe von 4-Cin wird der Laktattransport zwischen Astrozyten und Neuronen blockiert, was sowohl zur sofortigen als auch zur 24-Stunden-Aufhebung der WFR führt und außerdem einen Infarkt verursacht, wie er in der postmortalen Histologie beobachtet wird. Diese funktionellen und strukturellen Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle des Laktat-Shuttles im Neuroprotektionsprozess nach pMCAo bei Ratten. Ein weiterer Beweis für die ANLS-Unterstützung bei der Neuroprotektion unseres pMCAo-Modells ergibt sich aus unserer Feststellung, dass das Infarktvolumen direkt proportional zur Größe der Dura-Schlitze oder dem Volumen der kortikalen Region ist, in der ANLS gehemmt wurde, wie in Abb. 8 dargestellt.

Ein wichtiges Ergebnis unserer Studie ist, dass wir gezeigt haben, dass die Blockierung des ANLS-Transports unter normalen Bedingungen (Schein, Gruppe 2) während der Anwendung von 4-Cin auch starke auslöschende Auswirkungen auf die abgebildete WFR hatte, was durch das vollständige Verschwinden aller drei belegt wurde unterschiedliche WFR-Phasen (Abb. 4). Zur Bestätigung dieser Ergebnisse berichteten frühere Studien, dass die Blockierung des Laktattransports durch Herunterregulierung der MCT-Transporter (MCT2 oder MCT4) die kortikal hervorgerufene BOLD-Reaktion auf die Whisker-Stimulation (entspricht der ISOI-Überschwingungsphase) aufhebt, gemessen durch fMRT und durch Kernspinresonanzspektroskopie57,58,59 ,60.

Wir konnten unsere Ergebnisse mithilfe zweier sehr unterschiedlicher Arten von Whisker-Stimulationsprotokollen verallgemeinern. In dieser Studie wurde ein spärliches Protokoll angewendet, das in allen unseren vorherigen Schutzstudien verwendet wurde, mit dem Vorteil, zwei der drei Phasen (anfänglicher Abfall und Überschwingen) quantifizieren zu können, die auch mit leistungsstarken BOLD-Geräten abgebildet werden können. fMRT nach sensorischer Stimulation. Das komprimierte Protokoll zeigt nur eine Phase, sein Vorteil liegt jedoch in seiner Ähnlichkeit mit den Whisker-Stimulationsparametern bei natürlich quirligen Ratten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die räumliche und zeitliche WFR unter allen verschiedenen Interventionsbedingungen und verwendeten Medikamenten (Gruppen 1–3) für beide Whisker-Stimulationsprotokolle erhalten bleibt und belegen somit, dass der ANLS-basierte Schutz unabhängig von diesen sehr unterschiedlichen Stimulationsprotokollen erfolgreich ist.

Nach Jahren der Kontroverse über die Energiequelle aktiver Neuronen wurde kürzlich gezeigt, dass die Energiequelle aktiver Neuronen im gesunden Gehirn entscheidend vom Grad der neuronalen Aktivität abhängt. Bei niedrigen neuronalen Aktivitätsniveaus nutzen Neuronen Blutzucker, wohingegen ein höheres Niveau neuronaler Aktivität eine Umstellung auf die Verwendung von Laktat durch das ANLS anstelle von Glukose induziert15. Im ischämischen Kortex sorgt die Whisker-Stimulation, wie sie in der aktuellen Studie angewendet wird, für eine starke Aktivierung des ischämischen Kortex. Unsere Ergebnisse belegen tatsächlich die Aktivierung des ANLS im ischämischen Kortex nach neuronaler Aktivierung, was darauf hindeutet, dass ähnliche Regeln hinsichtlich der Energiequelle für aktive Neuronen auch nach pMCAo gelten könnten. Unsere Ergebnisse konnten jedoch nicht unterscheiden, welcher ANLS-Typ als Laktatquelle aktiviert wurde, d. h. Glykogenolyse vs. aerobe Glykolyse in Astrozyten, und weitere Studien sind erforderlich, um den ANLS-Ursprung eindeutig zu klären. Darüber hinaus hat unsere Studie nur gezeigt, dass das ANLS ein notwendiger Teil des Schutzes durch Whisker-Stimulation ist, konnte jedoch keinen direkten kausalen Zusammenhang zwischen der Whisker-Stimulation und dem ANLS nachweisen, was weitere Experimente erfordert, um einen solchen Zusammenhang herzustellen. Bei blockiertem ANLS könnten Neuronen immer noch Glukose über Glukosetransporter aus dem Kollateralblutfluss aufnehmen und möglicherweise Laktat für den Energieverbrauch bereitstellen. Diese Möglichkeit ist aus drei Gründen unwahrscheinlich. Erstens wurde mithilfe von DOCT, einer Technik, die die Quantifizierung des Blutflusses und -flusses, des sensorisch hervorgerufenen Kollateralblutflusses nach pMCAo, ermöglicht, festgestellt, dass dieser nur etwa 10 % der Ausgangswerte ausmacht9 und daher ist dies bei so niedrigen Fluss-/Flusswerten nicht der Fall eine optimale Glukosequelle. Zweitens begünstigt eine hypoxische Umgebung die Glykogenolyse21. Drittens sind die Eliminierung der WFR und das Vorliegen eines Infarkts in Gruppe 4 (pMCAo + 4-Cin + 0 h) klare Hinweise auf eine kortikale Abhängigkeit von ANLS und schließen daher eine direkte neuronale Glukoseverwendung nach pMCAo aus.

Einige Forscher haben auch darauf hingewiesen, dass der Glykogengehalt im Basalzustand im Gehirn gesunder Ratten in einer sehr minimalen Menge (10–12 Mikromol/g) liegt, was nur dazu beitragen kann, das Gewebe nur wenige Minuten nach dem ischämischen Insult zu erhalten61. Unsere früheren und aktuellen Ergebnisse stützen jedoch nicht den Fall von „wenigen Minuten Unterstützung“ nach pMCAo, da wir zuvor gezeigt haben, dass der Kortex nach pMCAo auch ohne sensorische Stimulation noch mindestens 2 Stunden lang geschützt ist1,2. Die aktuelle Studie zeigt unterschiedliche Ergebnisse der Blockierung des ANLS in den Versuchsgruppen 4 (pMCAo + 4-Cin + 0 h) und 2 (Schein-pMCAo + 4-Cin + 0 h), was darauf hindeutet, dass das ANLS ansonsten Neuronen über einige Minuten hinaus unterstützt Seine Hemmung des 2-Stunden-Schutzzeitfensters sollte im Gegensatz zu unseren Ergebnissen in Gruppe 4 später keine neuroprotektiven Wirkungen blockiert haben. Insbesondere ist Glykogen nicht nur ein Vorläufer von Laktat, sondern auch ein Vorläufer des kortikalen Neurotransmitters Glutamat für die neuronale Stimulation erforderlich46. Als Reaktion auf den Anstieg des zytosolischen Na+ nehmen Astrozyten Glutamat auf und recyceln es durch den Glutamat-Glutamin-Zyklus und aktivieren die Glykolyse/Glykogenolyse, was zu ANLS führt, um den neuronalen Energiebedarf zu decken62. Wenn die neuronale Aktivierung aufgrund sensorischer Stimulation zunimmt, wird mehr Glutamat freigesetzt und folglich wird mehr Glykogen zur Unterstützung der aktiven Neuronen verwendet20.

Nach pMCAo könnte eine weitere mögliche Quelle der Astrozytenaktivierung (zur Auslösung von ANLS, die das ischämische Gehirn unterstützt) mit Veränderungen der neuronalen kortikalen Aktivität unterhalb der Schwelle im ischämischen Kortex zusammenhängen. Unsere früheren Ergebnisse unter Verwendung der Mikroelektrodenarray-Aufzeichnung im selben Rattenmodell haben gezeigt, dass es innerhalb weniger Minuten nach pMCAo zu einem bemerkenswert weit verbreiteten Aufbau einer engen räumlich-zeitlichen Synchronisation spontaner neuronaler Aktivitäts-Local-Field-Potentiale (LFPs) über die gesamte kortikale Tiefe und den gesamten Raum kommt Ausmaß des verschlossenen MCA-Territoriums, ohne parallele Veränderung der sensorisch hervorgerufenen LFPs und Spitzen im Vergleich zum Ausgangswert vor pMCAo. Eine solche LFP-Synchronisation nach pMCAo ist das Ergebnis zugrunde liegender synchroner Ausbrüche niederfrequenter Schwingungen23. Der kontinuierliche Aufbau einer solchen Synchronisation im Laufe der Zeit führt zu einem Infarkt, es sei denn, während des 2-stündigen Schutzfensters wird eine Whisker-Stimulation an den ischämischen Kortex abgegeben, was zu einer Desynchronisation der korrelierten LFPs und einem Schutz vor einem drohenden Infarkt führt, wie durch die postmortale Histologie bestätigt24. Die weit verbreitete Synchronität niederfrequenter Bursts, die dem LFP-Synchronisationsaufbau nach pMCAo zugrunde liegt, könnte auch zu einem hohen Energiebedarf zur Unterstützung dieser synchronen Burst-Aktivität beitragen, was wiederum zu einem Anstieg der Nachfrage nach Laktat führen könnte. Diese Ergebnisse zeigen zusammen mit den Beiträgen des Kollateralunterstützungssystems und des ANLS-Unterstützungssystems, dass der Schutz durch sensorische Stimulation nach pMCAo eine mehrdimensionale integrierte Aktivität ist, an der Neuronen, Astrozyten und Blutgefäße beteiligt sind, die alle Mitglieder der NGV-Einheit mit Astrozyten sind ist der Schlüsselregulator der neurometabolischen und neurovaskulären Kopplung63.

Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist, dass ANLS neben dem Kollateralblutfluss während des hyperakuten Zustands nach pMCAo eine zentrale neuroprotektive Komponente ist. Die meisten relevanten präklinischen und klinischen Arbeiten konzentrierten sich bislang auf die Verabreichung von exogenem Laktat nach Ischämie, was die Neuroprotektion durch Reduzierung der Infarktläsion der ischämischen Region verbessert19,64,65,66,67,68,69,70,71,72. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die sensorische Stimulation von Neuronen und Astrozyten im ischämischen Bereich einen Schutz über ANLS ermöglicht, ohne dass eine externe Laktatverabreichung erforderlich ist. Dies zeigt die Fähigkeit des Kortex, sich nach pMCAo selbst aufrechtzuerhalten, wenn die neuronale Stimulation innerhalb des kritischen Zeitfensters erfolgt zum Schutz.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie mit früheren Studien übereinstimmen, die darauf hindeuten, dass der Laktat-Shuttle für die Erhaltung der neuronalen Funktion wichtig ist, insbesondere bei einem pathologischen Zustand wie Ischämie, und die wichtige Komponente der neuronalen Aktivierung hervorheben, die in früheren Studien größtenteils übersehen wurde. Der astrozytische Laktat-Shuttle als Reaktion auf die neuronale Aktivierung könnte zusammen mit dem Kollateralblutfluss und der LFP-Desynchronisation potenziell am Schutz des ischämischen Kortex in unserem pMCAo-Modell beteiligt sein. Wir glauben, dass unser pMCAo-Schlaganfallmodell in Verbindung mit sensorischer Neuroprotektion bei Ratten und mit einem besseren Verständnis, warum dieser Schutz bei Mäusen73 und hypertensiven Ratten74 versagt, die Möglichkeiten zum Schutz des ischämischen Kortex vor einem drohenden Infarkt weiter erweitern könnte.

Der aus Rohbildern generierte Datensatz ist auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Finanzierung erfolgte durch das National Institute of Health (NINDS: NS126526, NS119852) und die Leducq Foundation (Grant-Nummer: 15CVD02). Wir danken Hayden Malone und Linh Hoang für ihre Hilfe während der Experimente und Waqas Rasheed für seine Hilfe beim GUI-Design.

Abteilung für Neurobiologie und Verhalten, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, Irvine, CA, USA

Mehwish S. Bhatti und Ron D. Frostig

Abteilung für Biomedizintechnik, School of Engineering, University of California, Irvine, Irvine, CA, USA

Ron D. Frostig

Zentrum für Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses, University of California, Irvine, Irvine, CA, USA

Ron D. Frostig

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RDF und MSB konzipierten die Experimente. MSB führte die Experimente durch, führte statistische Analysen durch und generierte Zahlen. Beide Autoren haben das Manuskript geschrieben und rezensiert.

Korrespondenz mit Mehwish S. Bhatti oder Ron D. Frostig.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bhatti, MS, Frostig, RD Der Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle spielt eine zentrale Rolle bei der sensorischen Neuroprotektion in einem Rattenmodell mit permanentem Verschluss der mittleren Hirnarterie. Sci Rep 13, 12799 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39574-9

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Eingegangen: 15. März 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39574-9

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